6月5日，記者從中國科學(xué)院青島能源所獲悉，該所單細(xì)胞中心基于自主研制的RAGE(重力驅(qū)動單細(xì)胞液滴包裹拉曼分選)技術(shù)、儀器和相應(yīng)試劑盒，首次實現(xiàn)了精確到一個細(xì)菌細(xì)胞、全基因組覆蓋度超過92%的環(huán)境菌群scRACS-Seq，為環(huán)境微生物組原位代謝功能研究提供了一個強(qiáng)有力的新工具。

單細(xì)胞拉曼分選耦合測序(RACS-Seq)是剖析環(huán)境菌群功能機(jī)制的重要手段，但拉曼分選后單個細(xì)菌細(xì)胞基因組的覆蓋度通常低于10%，極大限制了其應(yīng)用。

土壤是地球上最重要的生態(tài)系統(tǒng)之一，土壤微生物組的代謝活動支撐著農(nóng)業(yè)與畜牧業(yè)，也在地球元素循環(huán)、全球氣候變化中起著關(guān)鍵性作用。同時，土壤菌群也是地球上最多樣與最復(fù)雜的微生物組之一，而其中大部分微生物尚難以培養(yǎng)，因此，單個細(xì)胞精度的拉曼分析-分選-測序(Single-cell RACS-Seq，簡稱scRACS-Seq)策略，是剖析土壤等環(huán)境菌群之代謝機(jī)制的重要手段。然而針對環(huán)境菌群的scRACS-Seq一直以來存在兩大瓶頸，一是難以無損、快速地獲取具有特定拉曼表型的單個細(xì)胞;二是難以獲得高覆蓋度的單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)。這已經(jīng)成為scRACS-Seq技術(shù)體系在復(fù)雜菌群中得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸。

針對這一業(yè)界共性難點(diǎn)問題，該所單細(xì)胞中心荊曉艷、公衍海和徐騰等組成的聯(lián)合攻關(guān)小組，基于前期發(fā)明的RAGE-Seq技術(shù)(Raman-activated Gravity-driven Encapsulation and Sequencing; Xu, et al, Small, 2020)，從液相拉曼分析穩(wěn)定同位素底物飼喂的土壤菌群出發(fā)，將特定拉曼表型的細(xì)菌單細(xì)胞精準(zhǔn)分離并包裹到皮升級液滴中，進(jìn)而耦合下游基因組測序。結(jié)果表明：(i)土壤菌群中細(xì)胞代謝活躍的低豐度物種(如Corynebacterium spp., Clostridium spp., Moraxella spp., Pantoea spp. 和 Pseudomonas spp.等)可經(jīng)耦合重水飼喂與標(biāo)記的RAGE-Seq精準(zhǔn)地識別和分選，其單細(xì)胞基因組覆蓋率可高達(dá)近93%;(ii)同樣，基于RAGE-Seq，含類胡蘿卜素的土壤微生物細(xì)胞(如Pantoea spp., Legionella spp., Massilia spp., Pseudomonas spp., 和Pedobacter spp.等)能實現(xiàn)單個細(xì)胞分辨率、高基因組覆蓋度的代謝重建，從而完整、深入地挖掘其類胡蘿卜素合成途徑;(iii)這些“原位”合成類胡蘿卜素的土壤微生物細(xì)胞中，既有代謝活躍的，也相當(dāng)部分是惰性的，表明基于純培養(yǎng)的策略勢必錯失這些代謝惰性的功能微生物，因此“原位”、單細(xì)胞精度的功能細(xì)胞識別和分離，對于全面、客觀的菌群功能剖析和資源挖掘具有重要意義。

據(jù)介紹，該工作還通過組分與狀態(tài)均精確可控的人工菌群，建立了系統(tǒng)且嚴(yán)格的scRACS-Seq質(zhì)量評價與控制體系。基于該體系，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能將不同拉曼表型的細(xì)菌單細(xì)胞從菌群中快速、精準(zhǔn)分離，在保證單細(xì)胞拉曼光譜質(zhì)量的同時，分選準(zhǔn)確性達(dá)100%。以來自于靶標(biāo)細(xì)胞周圍水相的空液滴為陰性對照，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)細(xì)胞序列中被菌群中其他細(xì)胞DNA污染的概率極低。上述工作定量證明了scRACS-Seq的靈敏度、特異性和可靠性。

作為RACS技術(shù)家族的新成員，scRACS-Seq可以在復(fù)雜菌群中以單個微生物細(xì)胞的分辨率建立新陳代謝與基因組的聯(lián)系，從而精確回答“誰在做什么，為什么”。在此基礎(chǔ)上，單細(xì)胞中心研制和產(chǎn)業(yè)化了單細(xì)胞拉曼分選-測序耦合系統(tǒng)(RACS-Seq儀器)，以及相應(yīng)的RAGE芯片和單細(xì)胞分析試劑盒(包括環(huán)境樣品中微生物單細(xì)胞提取與制備、穩(wěn)定同位素飼喂細(xì)胞、單細(xì)胞核酸裂解與擴(kuò)增等環(huán)節(jié))。該系統(tǒng)廣譜適用于細(xì)菌、古菌、真菌和動植物細(xì)胞，正服務(wù)于涵蓋各種復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的研究和應(yīng)用。

該工作由該所單細(xì)胞中心徐健研究員和馬波研究員主持，與中國科學(xué)院南京土壤研究所賈仲君研究員等合作完成。 (記者 王健高 通訊員 劉佳)